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基础医学

高级病理生理学实验技术

作者：刘玲

出版社：科学出版社出版时间：2023-02-01

开本： B5 页数： 120

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版权信息
内容简介
目录
节选

高级病理生理学实验技术版权信息

ISBN：9787030744791
条形码：9787030744791 ; 978-7-03-074479-1
装帧：一般胶版纸
册数：暂无
重量：暂无
所属分类：
医学
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基础医学

高级病理生理学实验技术内容简介

**章、常用心血管疾病实验动物模型小鼠和大鼠心肌细胞的分离方法和注意事项体外心肌细胞钙离子成像体外诱导多能干细胞向心肌细胞分化心肌梗死大动物模型构建：--猪心肌梗死模型的构建心肌梗死小动物模型构建-小鼠和大鼠心肌梗死模型的构建小鼠主动脉缩窄模型构建不同程度压力过载所致心室重构的影响和实验方法离体心脏Langendorff灌注实验小鼠心肌再生模型构建第二章、人多能干细胞来源的神经前体细胞的体内移植及鉴定人胚胎干细胞的培养和多能性的鉴定小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养和滋养层细胞的制备体外胚胎干细胞向神经细胞的定向分化皮肤细胞体外重编程生成诱导多能干细胞多能干细胞体内畸胎瘤形成实验小鼠帕金森病模型的构建神经前体细胞的脑内移植、功能鉴定第三章、肝小鼠慢性肝脏纤维化模型的构建第四章、整体肾脏免疫荧光染色及共聚焦3D重建第五章、新冠肺炎病原体棘突糖蛋白和抗体的分析第六章、组织工程皮肤的构建及对皮肤缺损的修复

高级病理生理学实验技术目录

目录
**章　常用心血管疾病实验动物模型　1
**节　体外分离心房和心室肌细胞　1
第二节　体外测量心肌收缩和Ca2+瞬变　10
第三节　猪心肌梗死模型：导管介入法　14
第四节　小鼠心肌缺血模型　21
第五节　小鼠主动脉缩窄模型　25
第六节　不同程度压力过载所致心室重构研究　31
第七节　朗根多夫（Langendorff）灌注法评估大鼠心功能的体外模型　35
第八节　心肌再生小鼠动物模型　39
第二章　人多能干细胞培养、神经定向分化与脑内移植　48
**节　小鼠胚胎成纤维细胞的分离和滋养层细胞的制备　48
第二节　人胚胎干细胞的培养和多能性的鉴定　50
第三节　皮肤成纤维细胞体外重编程生成诱导多能干细胞　53
第四节　基于规律性重复短回文序列簇（CRISPR/Cas9）系统构建人胚胎干细胞基因编辑细胞系　57
第五节　人胚胎干细胞体内畸胎瘤形成实验　63
第六节　体外人胚胎干细胞向肝细胞的定向分化　67
第七节　体外人胚胎干细胞向心肌细胞的定向分化　70
第八节　体外人胚胎干细胞向神经细胞的定向分化　76
第九节　人源神经前体细胞在小鼠脑内的移植实验　85
第十节　人源神经前体细胞在小鼠脑内移植的鉴定实验　88
第三章　小鼠慢性肝脏纤维化模型　93
第四章　整体肾脏免疫荧光染色及共聚焦三维重建　97
第五章　新型冠状病毒刺突蛋白和抗体的分析　102
第六章　表皮-真皮组织工程化复层皮肤的体外构建　109
参考文献　113

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高级病理生理学实验技术节选

**章常用心血管疾病实验动物模型 **节体外分离心房和心室肌细胞摘要高质量的心肌细胞分离对于在细胞和分子水平上成功研究心肌功能至关重要。尽管众多的科研工作己经为不同种类的心肌细胞建立了分离程序，但是要持续得到存活率高和功能完善的心肌细胞仍然是实验操作过程中面临的严峻挑战。朗根多夫（Langendorff）逆行灌注技术是从完整心脏分离心肌细胞*成功、*易复现的方法。在本章节中，我们将详细说明Langendorff分离大鼠心房和心室肌细胞的所有操作内容。这包括一系列必要的步骤，从快速主动脉插管开始冲洗心脏血液，用不含钙离子的溶液短时间灌注心脏，然后用含低钙离子的酶溶液长时间灌注，以破坏细胞外基质网络，提取释放的心肌细胞并温和地重新导入钙离子，使细胞逐渐恢复到正常的胞质钙离子水平。通过此方案分离的完整存活心室肌细胞得率约为70%（50%～90%）。通常心房肌细胞得率较心室肌细胞低，约10%。心肌细胞得率还取决于大鼠的年龄和心脏重塑的程度，因此动物年龄较大或发生重构的心脏（更多纤维化）通常会导致较低的得率。分离的心房和心室肌细胞可用于研究心肌细胞功能（如缩短/收缩、细胞内钙离子转化）以及生化和分子生物学研究（如免疫印迹、PCR）。 ―、引言成功体外分离出成年心肌细胞是在细胞和分子水平上研究和了解心脏生理和病理机制的重要手段和方法。胚胎心肌细胞和新生心肌细胞的研究不能简单适用于成年心肌，因为这些细胞在形态和超微结构以及重要离子通道、钙调节和收缩蛋白的表达方面与成年心肌细胞不同。类似的问题也同样存在于新近发展起来的诱导多能干细胞衍生而来的心肌细胞。分离的心肌细胞具有不受神经和体液影响的优点，为高度可控的体外细胞实验提供了理想的实验条件。此外，分离心肌细胞提供了从心脏不同区域（如左心房或右心房、左心室或右心室、梗死病变区域或心脏传导系统）选择细胞的可能性。高质量的心肌细胞分离对于新分离和培养细胞的成功研究至关重要，可以通过多种基因转染技术干扰靶基因的表达，从而研究靶基因在心肌细胞功能调控中的作用和分子机制。从20世纪70年代至今，各种分离心肌细胞的方法逐步发展起来。哺乳动物的心肌细胞分离可能因物种差异而有所不同。然而，主要的核心分离过程以及获得功能完整的、正常钙运作的心肌细胞所涉及的关键因素己经明确。在所有物种中，大鼠和小鼠可能是分离心肌细胞*常用的动物。Langendorff逆行灌注术是从完整心脏中分离活心肌细胞的*具重复性和*佳的酶分离技术。这种技术通过主动脉插管对心脏进行灌注，灌注缓冲液在压力下关闭主动脉瓣，与正常生理血流相反（逆行）沿升主动脉向下流动，从而充盈冠状动脉血管。本文介绍的方案描述了从大鼠心脏分离心房和心室心肌细胞的过程，并对先前发表的实验方案进行了相应修改。分离心肌细胞的主要步骤是通过快速主动脉插管进行灌注，使用低钙溶液清洗出心脏中的血液，用无钙的溶液短暂地灌注心脏，使心肌细胞在闰盘处解离，随后用含有蛋白水解酶的低钙溶液长时间灌注，从而降解单个细胞与细胞外基质网络的连接，提取解离的心肌细胞并温和地重新加入钙，使细胞逐渐恢复到正常的细胞液钙离子水平。在下文中，我们将详细说明分离大鼠心房和心室心肌细胞的所有步骤，强调成功制备细胞所需的*关键步骤。二、实验材料 1.设备（1）在恒流模式下运行的Langendorff装置、蠕动泵、水浴箱。（2）解剖用的光学显微镜或放大镜。（3）—个大小合适的不锈钢套管（直径2～3mm，取决于大鼠的大小）。（4）外科用丝线（5-0号）、注射器。（5）剪刀。（6）镊子、细弯锯齿钳。（7）300pm筛网、培养皿、盖玻片、Falcon试管。 2.溶液使用超纯水（ddH2O）制备所有溶液，用Milli-QA+超纯水系统处理，强烈推荐使用18.2Q分子生物学等级的水，所有的分离溶液都应该从基本分离缓冲液中新鲜制备（表1-1）。（1）基础分离台氏液（Tyrode’s solution）（见注意事项1）：130mmol/L NaCl，5.4mmol/L KCl，0.5mmol/L MgCl2，0.33mmol/L NaH2PO4，25mmol/L羟乙基哌嗪乙烷磺酸（HEPES），22mmol/L葡萄糖，0.01U/ml胰岛素（pH7.4）。（2）插管液：含有0.15mmol/LCaCl2和2U/ml肝素的分离台氏液（见注意事项2）。（3）心脏停搏液（置冰浴）含有25mmol/LKCl的插管液。（4）无钙溶液：含有0.4mmol/L乙二醇双2-氨基乙醚四乙酸（EGTA）的分离台氏液（见注意事项3），10mmol/L2，3-丁二酮肟（BDM）和2U/ml肝素。（5）酶溶液：含有 0.2mmol/L CaCl2，10mmol/L BDM，0.8mg/ml2型胶原酶，0.05mg/ml XW型蛋白酶的分离台氏溶液（见注意事项4）。（6）心房肌细胞停搏液：含有0.2mmol/L CaCl2， 10mmol/LBDM的分离台氏液。（7）心室肌细胞停搏液：含0.5mmol/LCaCl2，10mmol/L BDM （见注意事项5），2mg/ml牛血清白蛋白（BSA）的分离台氏液。（8）钙离子溶液1：含有1mmol/LCaCl2，2mg/mlBSA的分离台氏液。（9）钙离子溶液2：含有1.5mmol/LCaCU的分离台氏液。（10）麻醉剂：异氟醚。（11）层粘连蛋白。 3.动物12～16周龄健康雄性大鼠。三、实验方法 1.设置Langendorff装置（1）在分离过程中，Langendorff装置以恒流模式运行。在恒流模式下，心脏的灌注通过一个蠕动泵来实现，定期检查蠕动泵的流量，并调整到3ml/min，适当的灌注对于成功的心肌细胞分离非常重要。（2）Langendorff系统干净、无污染的管道和腔室也是非常重要的因素，每次隔离后，确保彻底清洗Langendorff系统（见注意事项6）。（3）打开水浴加热Langendorff系统的套管，使循环灌注液保持在37°C，同时定期检查灌注液的温度。（4）将所有用于灌注的溶液充氧以维持足够的O]供应，并防止心脏的缺氧状态（见注意事项7）。（5）向Langendorff装置中注入含氧的插管溶液，并避免任何气泡，以防止冠状动脉气栓阻塞。（6）为了有效地将主动脉固定到套管上，需要选用大小合适的不锈钢套管（直径为2mm的套管适用于年轻大鼠实验和直径为2.5～3.0mm的套管适用于年龄偏大的大鼠实验）和适当的5-0外科丝线。 2.心脏切除和插管（1）准备插管设置（图1-1），并在注射器中注入含肝素的插管溶液。清除注射器中的所有气泡，以防止空气进入冠状动脉。（2）根据当地动物伦理机构批准的方案麻醉和处死大鼠。在我们的方案中，大鼠用异氟醚麻醉并脱颈处死。（3）从中腹到横膈膜切开，用弯曲的锯齿状镊子夹住胸骨，双侧切开。反折胸腔露出心脏。将肝素溶液（1000U/ml）直接注入心脏（见注意事项8），以防止切除心脏时血液凝固。（4）小心地切除周围的非心脏组织，如肺和结缔组织。（5）用细弯锯齿钳轻轻提起心脏，从胸腔取出心脏，放入含氧的低温心脏停搏液中，然后轻轻地按压，初步去除一些心脏血液。（6）将心脏转移到装有含氧冰冷停搏液（见注意事项9）的100mm培养皿中（图 1-1）。（7）在确定主动脉和它的头颅分支（通常隐藏在胸腺后面）后，切断它**个分支下面的主动脉，迅速地将心脏滑到主动脉插管上。然后，用手术丝线做一个双结扎，以确保扎紧，并将插管液注入心脏（图1-1）。（8）将心脏转移到Langendorff系统（见注意事项10）。 3.心脏灌注和消化（1）以3ml/min的速率向心脏灌注含氧的无钙溶液，以清除残余血液，当心脏停止跳动时，表明无钙溶液已经到达心脏。（2）当无钙溶液到达心脏时，Langendorff仪器的导管应放置在含氧的酶溶液中。4分钟后，酶溶液可以到达心脏（见注意事项11）。（3）以3ml/min的速率向心脏灌注酶溶液，直到心脏出现肿胀、变软和变苍白（见注意事项12，图1-2）。当用镊子轻轻地按压时，心室会变形，心脏就像一个袋子一样悬着（图1-2）。在从心脏表面提取的一滴溶液中，可以发现许多解离的细胞。心房可能比心室消化得快（约几分钟）。当它们变得松软、苍白且易于取出时，应将其取下（见注意事项13）。 4.心房肌细胞的制备（1）取左心房和右心房，分别放入烧杯中，烧杯中加入0.5ml心房肌细胞停搏液，预热至37C。（2）用两把细镊子轻轻地解剖心房组织（图1-3）。然后将烧杯和心房组织放在摇床上，以促进细胞分离。（3）根据表1-2中的方案，每2分钟添加一次钙离子浓度增加的溶液，开始缓慢将钙离子浓度升高至正常生理浓度（见注意事项14）。（4）在钙离子浓度达到正常水平和调整心房肌细胞悬液细胞密度后，将心房肌细胞（图1-4）种在层粘连蛋白（laminin）涂层的盖玻片（或培养皿）上，并将细胞贴在盖玻片（或培养皿）底部约20分钟，就可以进行后续实验了。（5）心室肌细胞的制备 1）将心室（见注意事项15）放入烧杯中，用约10ml心室肌细胞停搏液预热至 37C。 2）轻轻地切碎心室（图1-3，见注意事项16）。 3）通过300pm孔径的筛布过滤去除未消化组织（图1-3）。 4）让细胞在重力作用下（图1-3，见注意事项17）静置10分钟，轻轻吸出上清液。

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