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分子生物学实验原理与技术 版权信息
- ISBN：9787030449269
- 条形码：9787030449269 ; 978-7-03-044926-9
- 装帧：一般胶版纸
- 册数：暂无
- 重量：暂无
- 所属分类：>
分子生物学实验原理与技术 内容简介
全书共列三十个分子生物学实验及其相关附录,内容不仅涵盖了基因克隆、基因表达、核酸及蛋白分子杂交等分子生物学常规实验,也包括基因检测、基因打靶、RNA干扰、蛋白分析等新型的分子生物学技术.每个实验包括原理介绍、实验操作、常见问题及注意事项.在介绍原理和流程过程中,穿插一些实用的重点提示、试剂作用及可能出现的现象.本书所列的实验流程均是编者们正在使用的、在教学中进行过实践的、切实可行的方法;所列常见问题及注意事项均是多年科研工作及教学实践的总结积累.
分子生物学实验原理与技术 目录
目录
前言
实验一 DNA的提取 1
实验二 核酸的定量 8
实验三 真核细胞总RNA的提取 11
实验四 PCR扩增目的基因 17
实验五 RT-PCR 25
实验六 DNA琼脂糖凝胶电泳 31
实验七 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 36
实验八 目的基因片段与载体的连接 39
实验九 用氯化钙法制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞 42
实验十 重组DNA的转化 44
实验十 DNA酶切 48
实验十二 转化克隆的筛选和鉴定 52
实验十三 质粒DNA的分离纯化 55
实验十四 含甘油培养物保藏法 65
实验十五 Southern blot分析 67
实验十六 Northern blot分析 74
实验十七 实时定量PCR技术 78
实验十八 环介导等温扩增技术 87
实验十九 mRNA差异显示技术 93
实验二十 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 97
实验二十一 SDS-PAGE检测蛋白质的表达 100
实验二十二 Western blot检测蛋白质的表达 107
实验二十三 双向电泳技术 114
实验二十四 DNA甲基化的检测 138
实验二十五 哺乳动物细胞中的RNA干扰技术 141
实验二十六 小鼠血浆microRNA提取技术 144
实验二十七 DNA芯片技术检测病原 147
实验二十八 TALEN载体的设计与构建 149
实验二十九 TALEN定点制备及筛选突变体 155
实验三十 CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术 157
主要参考文献 163
附录 166
前言
实验一 DNA的提取 1
实验二 核酸的定量 8
实验三 真核细胞总RNA的提取 11
实验四 PCR扩增目的基因 17
实验五 RT-PCR 25
实验六 DNA琼脂糖凝胶电泳 31
实验七 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 36
实验八 目的基因片段与载体的连接 39
实验九 用氯化钙法制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞 42
实验十 重组DNA的转化 44
实验十 DNA酶切 48
实验十二 转化克隆的筛选和鉴定 52
实验十三 质粒DNA的分离纯化 55
实验十四 含甘油培养物保藏法 65
实验十五 Southern blot分析 67
实验十六 Northern blot分析 74
实验十七 实时定量PCR技术 78
实验十八 环介导等温扩增技术 87
实验十九 mRNA差异显示技术 93
实验二十 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 97
实验二十一 SDS-PAGE检测蛋白质的表达 100
实验二十二 Western blot检测蛋白质的表达 107
实验二十三 双向电泳技术 114
实验二十四 DNA甲基化的检测 138
实验二十五 哺乳动物细胞中的RNA干扰技术 141
实验二十六 小鼠血浆microRNA提取技术 144
实验二十七 DNA芯片技术检测病原 147
实验二十八 TALEN载体的设计与构建 149
实验二十九 TALEN定点制备及筛选突变体 155
实验三十 CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术 157
主要参考文献 163
附录 166
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分子生物学实验原理与技术 节选
实验一 DNA的提取 【实验目的】 了解DNA提取的基本原理，掌握DNA的提取方法。 【实验原理】 遗传信息全部储存在DNA 一级结构之中，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。 一、分离纯化DNA的原则 (1)保持DNA分子一级结构的完整性。温度不要过高；控制一定的pH范围(pH5～9)，保持一定的离子强度，减少物理因素对核酸降解的机械剪切力。 (2)防止DNA的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需要高温灭菌，提取缓冲液中也需要加核酸酶抑制剂。 二、分离提取核酸的主要步骤 （一）细胞的破碎 细胞破碎的常用方法有以下几种。 (1)高速组织捣碎机捣碎； (2)玻璃匀浆器匀浆； (3)超声波处理法； (4)液氮研磨法； (5)化学处理法（SDS、Tween-80等）； (6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）。 （二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力（核酸与碱性蛋白的结合）、氢键和非极性的范德华力。分离核酸*困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。 提取DNA的一般过程是犄分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿／异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液再经过乙醇沉淀，使DNA从溶液中析出。 蛋白酶K能在SDS和EDTA-2Na存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA-2Na则抑制细胞中DNA酶(DNase)的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。 常见的DNA酶抑制剂如下： (1)金属离子螯合剂。DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Cap_的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-2Na等。 (2)阴离子型表面活性剂。如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中易于沉淀。 常用DNA提取原理如下。 (1)加入10倍体积的缓冲液：10 mmol/L Tris-HCI (pH 7.4)，150 mmol/L NaCI，10 mmol/L EDTA，0.50/ SDS。其中，NaCI破坏核酸一蛋白质间的静电引力，使氢键破坏，核蛋白解聚；EDTA破坏细胞膜、螯合Ca2_，使DNase失活；SDS可破坏细胞膜、抑制核酸酶，还可使核酸从蛋白质上游离m来。 (2)加入蛋白酶K。蛋白酶K是一神非特异性蛋白酶，它可将蛋白质消化成氨基酸。一般工作浓度是50--100 μg/mL。反应时间大于5h，反应温度55℃。 （三）核酸的沉淀 沉淀是浓缩核酸*常用的方法。优点：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。 1．常见的用于DNA沉淀的盐类及浓度（表1-1） 表1-1 DNA沉淀的盐类及浓度 注：Ae代表乙酸根。 2．有机沉淀剂 (1)乙醇。优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含少量乙醇易挥发除去。缺点：需要量大（2～3倍体积）。 (2)异丙醇。优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀；异丙醇难以挥发除去。 (3)聚乙二醇(PEG)。优点：可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段。应用PEG600进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需要加入0.5 mol/L的NaCI或10 mmol/L的MgCl2。 (4)精胺(spermine)。精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。原理：精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白酸杂质与DNA的提取DNA分开，达到纯化DNA的目的。 3．核酸沉淀的温度和时间 核酸沉淀应该在低温下长时间进行。若溶液中核酸浓度很高，在盐离子存在的情况下，加入异丙醇等后即可看到DNA的絮状沉淀。若溶液中核酸浓度很低，则需在-20℃条件下过夜。酵母tRNA可有助纳克(ng)级的核酸沉淀。大于10 μg/mL的核酸，冰浴10 min即可有效沉淀。 （四）核酸的保存 1．DNA DNA样品溶于pH 8．O的TE缓冲液中，4℃或-20℃保存，或者加1滴氯仿-70℃可保存数年。 2．RNA (1) RNA样品溶于含0.3 mol/L NaAc (pH 5.2)的2倍体积的乙醇中，-70℃保存。 (2)在RNA溶液中加1滴氯仿或0.2 mol/L VRC（氧钒核糖核苷复合物）冻存于-70℃，可保存数年。 （五）常见基因组DNA提取方法 1．基因组DNA提取CTAB法（植物DNA提取经典方法） 十六烷基三甲基溴化铵( hexadecVlt rimethvlammonium bro mide，CTAB)是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中(>0.7 mol/LNaCI)是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白质，多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离m来。CTAB提取缓冲液经典配方及改进配方见表1-2和表1-3。 表1-2 CTAB提取缓冲液的经典配方 CTAB法实验流程见图1-1。 2．基因组DNA提取——SDS法 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温(55--65℃)条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸；然后，提高盐（KAc或NHd Ac）浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚／氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 SDS法适用于大部分实验材料的基因组DNA提取，如动物组织、细胞、全血、细菌、酵母等。 SDS提取缓冲液配方见表1-4。 图1-1 CTAB法实验流程 表1-4 SDS提取缓冲液的配方 SDS法实验流程见图1-2（以动物组织为例）。 图1-2 SDS法实验流程 （六）几种常见细胞或组织DNA的提取 1．细菌基因组DNA的制备过程 (l)细胞裂解。0.6倍体积的异丙醇或2倍体积乙醇（可以加入1/10体积的3 mol/L乙酸铵辅助沉淀）。 (2) DNA纯化。CTAB除去多糖，酚氯仿一异戊醇除去蛋白质。 (3)沉淀DNA。10% SDS和蛋白酶K。 2．哺乳动物细胞基因组DNA的抽提过程 (1)组织粉碎。动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末；组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。 (2)细胞裂解。0.5% SDS和0.1 mg/mL蛋白酶K，50℃温育。 (3)沉淀DNA。用2倍体积的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇（加入1/10体积的3 mol/L乙酸铵可以辅助沉淀）。 3．从植物组织中制备DNA (1)组织粉碎。用液氮冷冻后研磨成细粉末。 (2)细胞裂解。用20/ CTAB/13-ME（十六烷基三甲基溴化铵／p巯基乙醇）或l%SDS和蛋白酶K，65℃温育。 (3)沉淀DNA：用0.6倍体积的异丙醇（-20℃）（可以加入1/10体积的3 mol/L乙酸铵辅助沉淀）。 【实验用品】 1．材料 动物组织。 2．器材和仪器 (1)恒温水浴锅。 (2)台式离心机。 (3)紫外分光光度计。 (4)移液器。 (5)玻璃匀浆器。 (6)离心管（灭菌）。 (7)吸头（灭菌）等。 3．试剂 (1)细胞裂解缓冲液。 Tris (pH 8.0)100 mmol/L EDTA (pH 8.0)500 mmol/L NaCI 20 mmol/L SDS 100/L 胰RNA酶20 μg/mL (2)蛋白酶K。称取20 mg蛋白酶K溶于1 mL灭菌的双蒸水中，-20℃备用。 (3) TE缓冲液(pH 8.0)。高压灭菌，室温保存。 (4)酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)。 (5)异丙醇。 (6)预冷无水乙醇。 (7) 70%乙醇。 (8)灭菌水。 (9) TIANamp Genomic DNA kit (DP 304)试剂盒。 【实验内容】 1．方法一 (1)取新鲜或冰冻动物组织块0.1 g(0.5 cm3)，尽量剪碎。置于研钵研碎，加入1 mL的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5 mL离心管中，加入蛋白酶K(500 μg/mL)20 μL，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30 min（也可转入37℃水浴12～24 h），间歇振荡离心管数次。在台式离心机上，以12 000 g离心5 min，取上清液人另一离心管中。 (2)加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100 μL吸头挑出，晾干，用200 μL TE重新溶解（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）。 (3)加等量的酚／氯仿／异戊醇振荡混匀，12 000 g离心5 min。 (4)取上层溶液至另一管，加入等体积的酚／氯仿／异戊醇，振荡混匀，12 000 g离心，5 min。 (5)取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5 mol/L乙酸铵和2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2 min，12 000 g离心10 min。 (6)小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 (7)用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀物1次，12000 g离心5 min。 (8)小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。 (9)加200 UL TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。 (10)吸取适量样品于紫外分光光度计上检测浓度相纯度。 2．方法二 使用TIANamp Genomic DNA kit (DP 304)试剂盒提取DNA。 (1)动物组织（小于10 mg）用液氮研磨后，加入200 μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。 (2)加入20 ljL蛋白酶K溶液(20 mg/mL)，混匀，56℃放置，直到组织溶解。 (3)加入200μ L缓冲液GB，充分颠倒混合，70℃放置10 min，直到溶液变清亮。 (4)加入200 L无水乙醇，充分振荡混合15 s。 (5)将所有溶液及絮状沉淀加入到吸附柱CB 3中（吸附柱放人收集管中），12 000 g离心30 s，弃滤液，将吸附柱放回收集管中。 (6)向吸附柱中加入500 μL缓冲液GD，12 000 g离心30 s，弃滤液，将吸附柱放回到收集管中。 (7)向吸附柱中加入700 μL漂洗液PW，12 000 g离心30 s，弃滤液，将吸附柱放回到收集管中。 (8)向吸附柱中加入500 μL漂洗液PW，12 00
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