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基因工程实验教程
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基因工程实验教程 版权信息
- ISBN：9787030373069
- 条形码：9787030373069 ; 978-7-03-037306-9
- 装帧：暂无
- 册数：暂无
- 重量：暂无
- 所属分类：
基因工程实验教程 内容简介
全书共包括有二十一个基因工程方面的基本实验，同时也涵盖了与基因工程密切相关的部分细胞培养技术、生物信息学微机操作技术等内容，书后还附有基因工程常用试剂配制、实验室常用数据和实验室安全的一般常识。每个实验都配有基础知识链接和背景资料的介绍，对每个实验的原理和操作步骤以及所出现问题的分析，力求解释详尽，以便于读者能较快地掌握实验原理和操作技巧。
基因工程实验教程 目录
目录
**部分 基因工程实验
**章 组织细胞遗传物质的提取（1）
实验一 动物胸腺或脾脏有核细胞基因组DNA提取（1）
实验二 哺乳动物组织mRNA提取（3）
实验三 植物组织的基因组DNA提取（6）
实验四 植物细胞RNA提取（8）
实验五 细菌基因组DNA的制备（10）
实验六 大肠杆菌质粒DNA的小量提取（12）
第二章 核酸凝胶电泳分离与纯化方法（15）
实验七 核酸的琼脂糖凝胶电泳（15）
实验八 DNA片段的回收与纯化（17）
实验九 紫外分光光度法测定核酸含量（19）
实验十 PCR反应及其产物检测（21）
第三章 DNA的重组连接和克隆的筛选鉴定（27）
实验十一 限制性内切酶切割DNA（27）
实验十二 DNA的重组和连接（32）
实验十三 大肠杆菌感受态细胞的制备和重组DNA分子的转化（35）
实验十四 重组转化子DNA的鉴定（蓝白斑筛选法）（39）
实验十五 转化克隆的筛选和鉴定（41）
实验十六 工程菌的诱导和酶活性检测（44）
实验十七 SDS PAGE电泳（48）
第四章 综合大实验（54）
实验十八 基因工程综合大实验（54）
实验十九 植物基因转化与转基因植株鉴定（57）
第五章 基因工程相关的其他实验方法（65）
实验二十 限制性片段长度多态性（RFLP）分析（65）
实验二十一 免疫印迹法（Western blot）检测蛋白表达（67）
第二部分 细胞培养技术
第六章 细胞培养的一般操作过程（74）
实验二十二实验器械、器皿的清洗、包装和消毒（74）
实验二十三 应用微孔滤膜过滤除菌（78）
实验二十四 细胞培养用液的配制（80）
实验二十五 小鼠肾脏细胞原代培养（82）
实验二十六 动物细胞的传代培养（85）
实验二十七 烟草叶片愈伤组织诱导和器官发生（86）
实验二十八 培养细胞的冻存与复苏（89）
实验二十九 细胞计数（91）
实验三十 细胞活力的测定方法（93）
实验三十一 动物细胞融合（94）
实验三十二 MTT法检测细胞相对数和相对活力（97）
实验三十三 细胞的基因转染实验—脂质体法（99）
第三部分 生物信息学
第七章 生物信息学实验（103）
实验三十四 生物信息学数据库（103）
实验三十五 核酸序列检索（106）
实验三十六 原核与真核生物核酸序列分析（109）
实验三十七 核酸序列分析和引物设计（120）
实验三十八 蛋白质序列分析（130）
第四部分附录
第八章 基因工程常用试剂配制及常用数据（141）
附录一 基因工程常用试剂配制（141）
附录二 PCR引物设计时常用Ⅱ型限制性内切酶的酶切位点保护碱基（154）
附录三 常用的基因工程型宿主菌的相关信息（157）
附录四 基因工程常用数据（159）
附录五 常用化学试剂的一般常识（167）
附录六 分子生物学综合数据库工具箱（176）
**部分 基因工程实验
**章 组织细胞遗传物质的提取（1）
实验一 动物胸腺或脾脏有核细胞基因组DNA提取（1）
实验二 哺乳动物组织mRNA提取（3）
实验三 植物组织的基因组DNA提取（6）
实验四 植物细胞RNA提取（8）
实验五 细菌基因组DNA的制备（10）
实验六 大肠杆菌质粒DNA的小量提取（12）
第二章 核酸凝胶电泳分离与纯化方法（15）
实验七 核酸的琼脂糖凝胶电泳（15）
实验八 DNA片段的回收与纯化（17）
实验九 紫外分光光度法测定核酸含量（19）
实验十 PCR反应及其产物检测（21）
第三章 DNA的重组连接和克隆的筛选鉴定（27）
实验十一 限制性内切酶切割DNA（27）
实验十二 DNA的重组和连接（32）
实验十三 大肠杆菌感受态细胞的制备和重组DNA分子的转化（35）
实验十四 重组转化子DNA的鉴定（蓝白斑筛选法）（39）
实验十五 转化克隆的筛选和鉴定（41）
实验十六 工程菌的诱导和酶活性检测（44）
实验十七 SDS PAGE电泳（48）
第四章 综合大实验（54）
实验十八 基因工程综合大实验（54）
实验十九 植物基因转化与转基因植株鉴定（57）
第五章 基因工程相关的其他实验方法（65）
实验二十 限制性片段长度多态性（RFLP）分析（65）
实验二十一 免疫印迹法（Western blot）检测蛋白表达（67）
第二部分 细胞培养技术
第六章 细胞培养的一般操作过程（74）
实验二十二实验器械、器皿的清洗、包装和消毒（74）
实验二十三 应用微孔滤膜过滤除菌（78）
实验二十四 细胞培养用液的配制（80）
实验二十五 小鼠肾脏细胞原代培养（82）
实验二十六 动物细胞的传代培养（85）
实验二十七 烟草叶片愈伤组织诱导和器官发生（86）
实验二十八 培养细胞的冻存与复苏（89）
实验二十九 细胞计数（91）
实验三十 细胞活力的测定方法（93）
实验三十一 动物细胞融合（94）
实验三十二 MTT法检测细胞相对数和相对活力（97）
实验三十三 细胞的基因转染实验—脂质体法（99）
第三部分 生物信息学
第七章 生物信息学实验（103）
实验三十四 生物信息学数据库（103）
实验三十五 核酸序列检索（106）
实验三十六 原核与真核生物核酸序列分析（109）
实验三十七 核酸序列分析和引物设计（120）
实验三十八 蛋白质序列分析（130）
第四部分附录
第八章 基因工程常用试剂配制及常用数据（141）
附录一 基因工程常用试剂配制（141）
附录二 PCR引物设计时常用Ⅱ型限制性内切酶的酶切位点保护碱基（154）
附录三 常用的基因工程型宿主菌的相关信息（157）
附录四 基因工程常用数据（159）
附录五 常用化学试剂的一般常识（167）
附录六 分子生物学综合数据库工具箱（176）
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基因工程实验教程 节选
**部分基因工程实验 **章组织细胞遗传物质的提取 实验一动物胸腺或脾脏有核细胞基因组DNA提取 一、相关知识链接 生物的基因组（genome）是指一套染色体中的完整DNA序列。二倍体生物由两套染色体组成，其中一套染色体的DNA序列就是一个基因组。基因组一词可以特指核基因组，亦可用来表示细胞质基因组，如粒线体基因组或叶绿体基因组等。 胸腺和脾脏是哺乳动物重要的免疫器官，胸腺主要是T细胞分化和成熟的场所，具有免疫调节和自身免疫耐受的建立和维持等功能。脾脏是T和B淋巴细胞的定居场所，同时也是免疫应答的发生场所，在胚胎期还有造血功能。T和B淋巴细胞均具有全套的基因组DNA，通过胸腺或脾脏有核细胞基因组DNA的提取，可以为研究相关哺乳动物的遗传物质提供物质基础。 二、实验原理 应用十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）在较高温度条件下裂解细胞，同时联合使用蛋白酶K，使组织或细胞中蛋白质（尤其是核酸酶）充分降解，使染色体离析，蛋白变性，并释放出核酸，然后采用盐溶的方法，加人高浓度的饱和NaCl溶液，*后采用等体积的异丙醇沉淀DNA，以达到释放和萃取高质量核酸的目的。 三、实验目的 掌握从动物组织中提取DNA的操作方法，制备高质量的基因组DNA，作为PCR扩增的模板或基因组分析。 四、实验材料和配方 （一）实验器材与设备 恒温水浴锅，高速台式离心机，漩涡振荡器，高压灭菌锅，电子天平，低温冰箱，手术剪，微量移液器（10000、1000），加样枪头（1000pl、100pl），1.5ml离心管。 （二）试剂与配方 1.DNA提取液10mmol/LTiis-HCl（pH8.0），2mmol/LEDTA（PH8.0），0.4mmol/LNaCl，1%SDS。 2.其他试剂蛋白酶K（20mg/ml），异丙醇，70%乙醇溶液，无水乙醇，6mol/LNaCl，溴化乙锭（EB）染色液。 五、实验方法和步骤 1.将用于抽提DNA的动物组织（胸腺或脾脏组织）约50mg放人1.5ml离心管中，用手术剪剪碎成匀浆。 2.加人500+1的DNA提取液和200蛋白酶K，充分混匀后，55～65T水浴2～3h。 3.加人375+1的6mo1/LNaCl溶液，在漩涡振荡器上振荡30see。 4.12000g条件下离心30min后，量取上清液，加人等体积异丙醇，-20℃静置40min。 5.12000g离心15min后，弃去上清液，70%乙醇洗涤沉淀1次，无水乙醇洗涤沉淀1次。 6.空气中自然干燥沉淀后，加20+1无菌水溶解DNA。 7.取5μ1进行电泳鉴定。 电泳操作步骤如下。 （1）倒胶：取出有机玻璃内槽及隔板，洗净、晾干。将有机玻璃内槽置于水平位置且在其一端和中间插人隔板（即只制半块胶），为防止漏胶，可用滴管吸取少量的凝胶封好隔板边沿，然后放好样品梳子，并使梳齿高于底板约1.0mm。 将已配制好的0.8%琼脂糖凝胶溶液，连同锥形瓶放进微波炉加热，直至琼脂糖完全熔化’待琼脂糖凝胶液冷却至60～70T，小心地倒在有机玻璃板内槽’控制好倒胶速度’使胶液缓慢地展开，直至在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层（胶厚约4mm），室温下静置30min左右，待凝胶完全凝固后（白色透明），取下有机玻璃板内槽两端的隔板，再将内槽放人电泳槽中，加人电极缓冲液，使液面高出胶面1～2mm。轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品孔。 （2）上样：取长约10cm的透明胶（或封口膜）贴在实验桌上，间隔2cm，用微量移液器依次点上1+1DNA上样缓冲液，然后量取3～5+1样品与其在透明胶上混匀，再小心吸取样品并将其加人到样品孔内。加样时应避免枪头戳破样品孔，同时也要避免碰坏样品槽周围的凝胶面。操作时可用右手持移液器，左手握住右手腕，左肘支撑桌面，防止点样时右手晃动。同时，在样品孔的一端点上DNA分子量标准物（DNAMarker）以便于比较待测样品分子量大小。 （3）电泳：加样完毕，盖上电泳槽盖，将靠近样品一端连接负极，另一端连接正极（注意电极方向，勿接反了），接通电源，调节电压100V开始电泳。当溴酚蓝指示剂移动到凝胶长度的4/5距离左右，可停止电泳。 （4）染色：将电泳后的凝胶板小心推至EB染色液中，室温下浸泡15min。 （5）观察：戴三层一次性手套，用专用铲子从凝胶染液中小心取出凝胶置于托盘上，在凝胶成像仪上将凝胶板推至成像仪内部的黑色玻璃板上，在波长大于254nm的紫外透射光下进行观察。DNA存在位置呈现亮带，电脑拍照，保存图谱。 六、结果分析与讨论 图1-1显示所提动物总DNA经琼脂糖凝胶电泳检测结果，所提取得到的DNA大片段大于20kl）（DNAMarker为λDNA/EcoRI￣HindⅢ酶切片段，即*大片段为21．2kb）。 **章组织细胞遗传物质的提取 七、注意事项 1.在基因组DNA提取之前，需将动物组织处理成匀浆。 2.在DNA提取过程中，染色体DNA会由于机械剪切力发生断裂，产生大小不同的片段，因此在细胞破裂后，应尽量在温和条件下操作。 3.提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，混匀试剂、吸取上清等操作时均应避免动作剧烈，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。 （李惠敏 刘红美 谭涛 张洁 冯乐平） 实验二哺乳动物组织mRNA提取 一、相关知识链接 1961年Jacob和Jacques Monod提出了信使RNA假说，认为细胞内肯定存在一种特殊的RNA是直接从DNA上合成的，它们的序列与DNA上的基因序列互补，然后被运输到细胞质中为蛋白质合成提供模板。mRNA的假说很快得到了Brenner、Jacob和Meselson等科学家的同位素实验确认，从而解决了遗传信息传递的问题。 生物细胞中的RNA主要包括信使RNA（mRNA），转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）以及各种特殊功能的小分子RNA等。mRNA是合成蛋白质的模板，tRNA是转运氨基酸的运载工具，rRNA则是蛋白质翻译场所核糖体的重要构成部件，mRNA的碱基序列，决定着蛋白质装配时氨基酸的序列，因此，研究RNA具有重要的生物学意义。 二、实验原理 绝大多数哺乳动物细胞的mRNA在其端均有一个poly（A）尾端，因此可以应用oligo（dT）纤维素亲和层析法从细胞总RNA中分离出mRNA。当总RNA流经oligo（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo（dT）纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗脱下来。经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃；可保存一年以上。 三、实验目的 掌握从哺乳动物组织提取mRNA的原理和方法，提取的mRNA可以用于RT-PCR以及Northern杂父分析。 四、实验材料和配方 （一）实验器材与设备 冷冻台式高速离心机，涡旋振荡机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外分光光度计，层析柱，研钵，微量移液器，离心管。 （二）试剂与配方 1.无RNA酶灭菌水用将高温烘烤的玻璃瓶（180T，2h）装蒸馏水，然后加人0.01%（体积比）的DEPC（ml/ml），处理过夜后高压灭菌。 2.75%乙醇用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装人高温烘烤过的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 3.1X层析柱加样缓冲液20mmol/LTris-HCl（pH7.6），0.5mol/LNaCl，1mmol/LEDTA（pH8.0），0.1%SDS。 4.洗脱缓冲液10mmol/LTris-HCl（pH7.6），1mmol/LEDTA（pH8.0），0.05%SDS。 5.其他试剂液氮，Trizol试剂盒，氯仿，异丙醇、3mol/LNaAc溶液（pH5.2）。 五、实验方法和步骤 （一）总RNA的提取（Trizol法） 1.将组织在液氮中磨成粉末后，将50～100mg组织加人1mlTrizol液研磨。 （注意：样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%）。 2.研磨液室温放置5min，然后以每1mlTrizol液加人0.2ml氯仿的比例加人氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15sec。 3.取上层水相于另一离心管中，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加人异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min。 4.弃去上清液，按每mlTrizol液加人至少1ml75%乙醇溶液的比例加人75%乙醇溶液，涡旋混匀，4℃7500g离心5min。 5.小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5～10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55～60T水溶10min。RNA可进行mRNA分离，或储存于70%乙醇溶液并保存于-70℃。 （二）mRNA提取 1.用0.1mol/LNaOH悬浮0.5～1.0goligo（dT）纤维素。 2.将悬浮液装人灭菌的一次性层析柱中或装人填有经DEPC处理，并经高压灭菌的玻璃棉巴斯德吸管中，柱床体积为0.5～1.0m1，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。 3.用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的PH<8.0。 4.将提取的总RNA液于65T温育5min后，迅速冷却至室温，加人等体积2x柱层析缓冲液后上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进人柱床后，加人1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。 5.测定每一管的OD2W值，当洗脱液中OD为0时，加人2～3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。 6.于260nm测定OD值，合并含有RNA的洗脱组分。 7.加人1/10体积的3mo1/LNaAc溶液（PH5.2），应用2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀于-20℃放置30min。 8.4℃下12000g离心15min，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5min。 9.小心弃去上清液，沉淀空气干燥10min，或真空干燥10min。 10.用少量DEPC水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇溶液中并贮存于-70℃）。 mRNA在70%乙醇中-70T；可保存一年以上。纤维素柱用后可用0.3m1/LNaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加人0.02%叠氮钠（Na%）冰箱保存，可重复使用。每次用前用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。 六、结果分析与讨论 （略） 七、注意事项 1.模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率，在构建cDNA文库时，必须经纯化步骤制备mRNA模板。由于mRNA分子的结构特点，容易受RNA酶的降解，加之RNA酶极为稳定且广泛存在，因此在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。 2.所有组织中均存在RNA酶，试剂和容器等也均可能被污染，因此实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200T烘烤2h以上。 3.凡不能用高温烘烤的材料，如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DE
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