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生物化学与分子生物学实验指导 版权信息
- ISBN：9787030609946
- 条形码：9787030609946 ; 978-7-03-060994-6
- 装帧：一般胶版纸
- 册数：暂无
- 重量：暂无
- 所属分类：>
生物化学与分子生物学实验指导 内容简介
本教材由常用实验仪器的基本原理与操作、生物化学与分子生物学的基本实验方法组成。在实验的的编写的选择中，力求配合生物化学与分子生物学的理论学习，注重对学生的基本实验操作和技能的培养，适当引进新技术和新方法宽展学生眼界。争取做到实验的科学性、实用性和适用性，以供全国广大读者使用。本书适合作为高等医学院校的本科及研究生适用，也可供医学生物化学及分子生物学教学和科研工作者参考。
生物化学与分子生物学实验指导 目录
目录
前言
实验须知 1
实验基本操作 4
一、玻璃仪器的洗涤 4
二、吸量管的使用 5
三、定量吸（移）液器 5
四、容量瓶及量筒 6
五、离心机及其使用方法 6
六、溶液的混匀 6
七、保温 7
八、过滤 7
九、加热 7
实验一 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳 8
实验二 蛋白质的两性性质及等电点测定 12
实验三 血清蛋白质的盐析及白球比的测定 15
实验四 双缩脲法测定血清蛋白质的含量 20
实验五 凯氏定氮法测定蛋白质含量 23
实验六 RIPA法提取肝总蛋白质 27
实验七 血清蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 29
实验八 影响酶活性的因素 33
一、温度对酶活性的影响 33
二、pH对酶活性的影响 34
三、激动剂和抑制剂对酶活性的影响 35
实验九 酶的竞争性抑制作用 37
实验十 维生素C的定量测定 39
实验十一 胰岛素、肾上腺素对家兔血糖浓度的影响 43
实验十二 饱食和饥饿小白鼠肝糖原含量的比较 46
实验十三 葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度 48
实验十四 血清中甘油三酯的测定 51
一、方法一 52
二、方法二 53
实验十五 血清中总胆固醇的测定 55
实验十六 酮体的生成和利用 57
实验十七 过氧化脂质的测定 61
实验十八 血清中肌酐浓度的测定（除蛋白碱性苦味酸法） 63
实验十九 核酸的定量测定（紫外吸收法） 65
实验二十 组织DNA的提取与鉴定 68
实验二十一 DNA和RNA浓度的检测 71
实验二十二 大肠杆菌质粒DNA的提取与纯化 73
实验二十三 肝总RNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定 78
实验二十四 反转录聚合酶链反应检测肝甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA 81
实验二十五 大肠杆菌的转化及重组子的筛选 87
实验二十六 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 91
实验二十七 质粒DNA的限制性内切酶消化及鉴定 94
实验二十八 质粒DNA与外源DNA的连接 97
实验二十九 人血管生长因子基因（hVEGF）的PCR定点突变 99
实验三十 荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒核酸 103
生物化学与分子生物学常用仪器设备介绍 107
一、通风橱 107
二、恒温摇床 108
三、细菌培养箱 109
四、PCR仪 112
五、台式高速离心机 113
六、比色分析法及721-B型分光光度计 115
七、微量移液器 117
八、数显恒温水浴锅 119
九、超净工作台 120
十、高压蒸汽灭菌锅 121
十一、pH计 123
十二、涡旋仪 124
分子生物学实验技术无菌操作原则 125
分子生物学实验无菌操作技术及注意事项 126
一、玻璃器皿的消毒和清洁 126
二、无菌器材和液体的准备 127
三、无菌操作过程 127
四、常用清洁液的配制方法 127
实验报告格式与内容 128
前言
实验须知 1
实验基本操作 4
一、玻璃仪器的洗涤 4
二、吸量管的使用 5
三、定量吸（移）液器 5
四、容量瓶及量筒 6
五、离心机及其使用方法 6
六、溶液的混匀 6
七、保温 7
八、过滤 7
九、加热 7
实验一 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳 8
实验二 蛋白质的两性性质及等电点测定 12
实验三 血清蛋白质的盐析及白球比的测定 15
实验四 双缩脲法测定血清蛋白质的含量 20
实验五 凯氏定氮法测定蛋白质含量 23
实验六 RIPA法提取肝总蛋白质 27
实验七 血清蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 29
实验八 影响酶活性的因素 33
一、温度对酶活性的影响 33
二、pH对酶活性的影响 34
三、激动剂和抑制剂对酶活性的影响 35
实验九 酶的竞争性抑制作用 37
实验十 维生素C的定量测定 39
实验十一 胰岛素、肾上腺素对家兔血糖浓度的影响 43
实验十二 饱食和饥饿小白鼠肝糖原含量的比较 46
实验十三 葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度 48
实验十四 血清中甘油三酯的测定 51
一、方法一 52
二、方法二 53
实验十五 血清中总胆固醇的测定 55
实验十六 酮体的生成和利用 57
实验十七 过氧化脂质的测定 61
实验十八 血清中肌酐浓度的测定（除蛋白碱性苦味酸法） 63
实验十九 核酸的定量测定（紫外吸收法） 65
实验二十 组织DNA的提取与鉴定 68
实验二十一 DNA和RNA浓度的检测 71
实验二十二 大肠杆菌质粒DNA的提取与纯化 73
实验二十三 肝总RNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定 78
实验二十四 反转录聚合酶链反应检测肝甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA 81
实验二十五 大肠杆菌的转化及重组子的筛选 87
实验二十六 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 91
实验二十七 质粒DNA的限制性内切酶消化及鉴定 94
实验二十八 质粒DNA与外源DNA的连接 97
实验二十九 人血管生长因子基因（hVEGF）的PCR定点突变 99
实验三十 荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒核酸 103
生物化学与分子生物学常用仪器设备介绍 107
一、通风橱 107
二、恒温摇床 108
三、细菌培养箱 109
四、PCR仪 112
五、台式高速离心机 113
六、比色分析法及721-B型分光光度计 115
七、微量移液器 117
八、数显恒温水浴锅 119
九、超净工作台 120
十、高压蒸汽灭菌锅 121
十一、pH计 123
十二、涡旋仪 124
分子生物学实验技术无菌操作原则 125
分子生物学实验无菌操作技术及注意事项 126
一、玻璃器皿的消毒和清洁 126
二、无菌器材和液体的准备 127
三、无菌操作过程 127
四、常用清洁液的配制方法 127
实验报告格式与内容 128
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生物化学与分子生物学实验指导 节选
实验须知 【实验目的】 1. 通过实验，加深对生物化学与分子生物学理论知识的理解。 2. 较熟练地掌握生物化学与分子生物学实验基本操作技术。 3. 培养学生具备严谨的科学态度和工作作风，使其分析问题和解决问题的能力逐步提高，为学习医药学专业课程打下基础。 【实验要求】 实验前必须预习本实验指导，复习理论知识，明确当次实验的实验目的、原理、操作关键步骤及注意事项、计划安排、实验时间等。实验时严肃认真，一丝不苟地进行操作，仔细观察和综合分析实验所出现的现象与结果，及时将现象与结果记录下来。实验完毕，将所在实验组的实验台整理干净，清点仪器、试剂，然后请实验指导教师审核签字。 【仪器保管及清洁】 1. 常用仪器在**次实验时按仪器清单清点，签名后自己负责保管，如有缺损应向教师报告并填写破损单，经教师同意并签名后到实验准备室换领。 2. 贵重仪器如比色计、离心机等必须尽力爱护，使用前熟悉它们的使用方法，严格遵守操作规程，非本次实验贵重仪器，未经教师许可不得乱动。 3. 实验后必须把仪器洗净，按次序放入柜内，以提高工作效率并防止破损。 【实验时注意事项】 1. 遵守实验课纪律，不迟到、不早退，进实验室要穿好实验服，避免给实验带来不可预知的结果，或造成衣服被酸碱腐蚀。 2. 进实验室前准备好实验指导、实验记录本、文具等，其他非实验所需物品严禁带入实验室。 3. 实验室是培养学生独立思考、独立工作的能力及良好科学作风的重要场所，操作务必认真，不得喧哗，严禁用器械及动物开玩笑。实验后要清扫台面、地面，试剂瓶要码放整齐。 4. 爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 5. 保持实验台整洁，试剂、仪器应摆放整齐，按次序放置。实验完毕按各类仪器清洗方法和要求将仪器妥善归置。 6. 应当爱护贵重仪器，如分光光度计、离心机等，使用前熟悉其使用方法，严格遵守操作规程，严禁随意开动。 【试剂使用规则】 1. 使用试剂前，应先仔细辨认试剂瓶标签，看清试剂种类、浓度是否对应本次实验。 2. 取完试剂后，立即将瓶塞盖好，切勿盖错，应放回原处。未用完的试剂不得倒回瓶内。试剂瓶塞、专用吸量管、滴管应与试剂瓶对应，以免错用而污染试剂，造成自己或他人实验失败。 3. 取标准溶液时，应先将其倒入干净的试管中，再用内外洁净吸管从试管中吸取，以免污染标准溶液。 4. 使用滴管时，须滴管尖端朝下，切勿倒置使试剂流入橡皮内，以免污染溶液。 5. 使用有毒试剂及强酸碱时，尽可能用量筒量取，若用吸管时只能用橡皮球吸取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。 【安全注意事项】 1. 低沸点有机溶剂，如乙醚、乙醇、丙酮等均为易燃物品，不得直接在火上加热，要用水浴加热，这些物品应远离火源。 2. 凡属发烟或产生有毒气体的实验均应在通风柜内进行，以免产生毒害。 3. 万一发生酸碱灼伤事故，应先用大量的自来水冲洗，然后用饱和NaHCO3溶液中和酸，用饱和H3BO3溶液中和碱，用Na2SO4处理氧化剂。 4. 万一发生起火事件，应根据起火性质分别用沙或水等灭火。 5. 离开实验室时，必须关好门窗，切断电源、水源。 【实验室清洁】 1. 实验室、实验台面须经常保持洁净，实验后应擦拭干净，不得随地吐痰、丢纸屑。 2. 实验用过的固体物（如棉花、滤纸、火柴梗等）不要丢在桌上或水池中，应放入废物缸内。 3. 下课时轮流由值日生打扫卫生，经教师检查后，方能离开实验室。 【值日生任务】 1. 搞好实验室卫生，做到仪器、桌面、地面、水池等干净、整洁。 2. 确保安全，关好仪器、门窗、水电。 3. 请指导教师及准备室教师检查后方能离开实验室。 【实验报告】 每次做完实验，须及时整理实验记录，依照规定格式和内容写出实验报告，根据实验结果进行科学分析并交指导教师评阅。报告内容包括实验时间、实验地点、实验名称、实验目的、实验原理、实验试剂与仪器、指导教师、实验操作、实验结果、实验分析、实验结论、思考题等项目。 实验目的、实验原理、实验试剂与仪器及实验操作等只作简明扼要的叙述，不必将本实验指导的内容原版抄录。但对实验条件、操作要点等实验成败的关键环节应作清楚的描述。使用精密仪器进行实验时，还应记录仪器的型号、名称、厂家。 实验结果首先是如实记录实验中观察到的现象及各种原始数据，还包括根据实验要求进行整理、归纳数据后进行计算的过程及计算结果，根据实验数据计算作出的图表（采用三线表）等。 实验分析不是对结果的重述，而是对实验结果、实验方法和异常现象进行解析和评论，以及对实验设计的认识、体会及建议。 一般要有实验结论。结论简单扼要，从而说明本次实验所获得的结果。 实验报告根据以往开设实验的情况，具备封面及报告正文。格式见附录“实验报告格式与内容”。 实验基本操作 生物化学与分子生物学实验中需要多种基本技术操作，如各种玻璃仪器和测量仪器的正确使用、样品混匀、保温、加热、沉淀、过滤和离心等。如果这些操作不规范，将影响实验结果的准确性。因此，要求学生对生物化学与分子生物学实验基本操作加以了解和掌握，是非常重要的。 生物化学与分子生物学实验多用定性及定量分析方法观察物质代谢的规律，必须做到洁净及定量的准确，为做好这一点，我们先介绍一些基本操作，并要求学生反复练习，以达到熟练的程度。 一、玻璃仪器的洗涤 在生物化学与分子生物学实验中，玻璃仪器清洁是获得准确结果重要的一环。洁净玻璃仪器的内壁应十分明亮光洁，无水珠附着在管壁上，下面介绍一些常用的洗涤方法。 1. 一般仪器如烧杯、试管等，可用合成洗涤剂、去污粉等和毛刷仔细刷洗后，再用自来水冲干净。*后用少量的蒸馏水冲洗2～3次，倒置晾干或置烘箱烘干后备用。 2. 容量分析仪器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗，可在用毕后即用自来水冲洗，直至不挂水珠，再用少量的蒸馏水冲洗2～3次即可晾干备用。若冲洗后的仪器仍挂水珠，则应将其沥干后，再用重铬酸钾洗液浸泡4～6h，然后用自来水冲洗干净，再用少量蒸馏水冲洗2～3次。 3. 比色杯用毕立即用自来水反复冲洗，如有污染物黏附于杯壁，宜用盐酸或适当的溶剂清洗。然后用自来水、蒸馏水冲洗干净。勿用刷子、粗糙布等擦拭。洗净后倒置晾干备用。 4. 新购量器表面常附有游离的碱性物质及泥污，可先用去污粉刷洗再用自来水洗净，然后浸泡在1%～2%盐酸溶液中过夜（不少于4h），再进一步洗涤，然后用蒸馏水荡洗2～3次，倒置于仪器架上晾干备用。 二、吸量管的使用 吸量管是用来转移一定体积溶液的量器，生物化学与分子生物学实验中常用的吸量管有以下三种。 1. 刻度吸量管：刻度吸量管有0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL等规格。刻度吸量管又分刻度到尖端和刻度不到尖端两种，使用前需仔细辨认，如使用前者，将液体放出后，应用洗耳球吹出*后留在管内的液体。 2. 移液吸量管：也称容量吸管或胖肚吸管，是一种单一刻度吸管，中间呈圆柱状膨大，为定量移出整量液体之用。有5mL、10mL、20mL、25mL、50mL及100mL等规格。将所量取液体放出后，只需将移液吸量管尖端触及受器壁约半分钟即可，不得吹出尖端液体。如管壁刻有吹字，则应吹出。 3. 奥氏吸量管：又称欧氏吸管，也是一种单一刻度的吸管，中下部呈球形膨大，故液体与吸量管表面接触面积较小，用于吸取血液及较黏的液体。流放液体时，应让其自然缓慢地流出，减少内壁黏附。若为吹出式，管尖*后一小滴应吹出。有1.0mL、2.0mL、5.0mL等规格。 正确使用方法：使用吸量管时，先要看清刻度情况，选择适当容量的吸量管（等于或稍大于所需毫升数）。拿吸量管时，标有刻度的一面正对己侧，以便读取刻度。用右手中指和拇指拿住吸量管上部，把管尖端插入要取液体大约0.1cm深处。左手持洗耳球把容器内的液体吸至刻度上方时，立即用右手食指按住吸量管管口，以稳住吸量管内的液体，将吸量管下端提出液面，慢慢松开食指使液面的月弯面*低点下降至所需刻度处（眼睛与刻度线处于同一水平面上），立即用食指堵紧，然后将吸量管插到需加液体容器中，让其尖端与容器内壁靠紧，松开食指让液体流出。液体流完后再等15s，捻动一下吸量管后移去。 三、定量吸（移）液器 定量吸（移）液器是吸量管的革新产品，使用方便，取、加样迅速，计量准确，不易破损，能吸取多种样品（只换吸嘴即可）。定量吸（移）液器有以下两种类型。 1. 固定式：只能取、加一定容量，不能调节。 2. 可调式：在一定容量范围内可根据需要调节取、加量，如0～200μL。 四、容量瓶及量筒 容量瓶是一种细长颈梨形平底瓶，具有磨口塞，颈上有标线，表示所示温度（一般为 20℃）条件下，当液体充满到标线时，液体体积恰好与瓶上所注明的体积相等。容量瓶有10mL、25mL、50mL、100mL、200mL、250mL、500mL、1000mL、2000mL等规格。使用容量瓶装配制的溶液时，一般是先将固体物质在烧杯中用少量溶剂溶解，然后将溶液沿玻璃棒定量地转移到容量瓶中，烧杯用少量的蒸馏水冲洗2～3次，并注入容量瓶中，再加入溶剂混匀稀释。当稀释至液面接近标线时，应等待1～2min，使附在瓶颈内壁的液体流下，并待液面的小气泡消失后，再用滴管逐滴加入溶剂，使之恰至刻度处，即溶液弯月面下缘*低点和标线相切。然后将其瓶塞塞好，反复倒置摇动数次使其充分混匀。容量瓶不能直接用火加热，水浴加热时不宜骤热和骤冷，也不能置于烘箱烘烤，以免变形而引起容量发生误差。 量筒：所量取液体不用十分精确时可使用量筒，比使用吸管或容量瓶更简便，量筒底座及筒身是一体的，故不能量取过热液体，更不能直接加热，以防炸裂。 五、离心机及其使用方法 离心法是分离沉淀物的一种方法。它是利用离心机转动的离心力，使相对密度较大的沉淀物沉积在管底部，以达到分离的目的。离心机使用方法如下。 1. 检查离心机套管底部垫子，若有玻璃碎片等，必须除去，以免发生破管。 2. 将待离心液体置于离心管或小试管中，并检查离心管（或小试管）的大小与离心机套管是否匹配。 3. 将盛有离心液的离心管分别放入套管中，然后连套管一起分置于托盘天平两侧，通过往离心管与套管间滴加水来调节两边质量使之达到平衡。 4. 将已平衡的两支装有离心管的套管分别放入离心机相互对应的两插孔内，盖上离心机盖。打开电源开关，逐步扭动转速旋钮，缓慢增加离心机转速至所需转速。达到离心所需时间后将转速旋钮逐步回零，待离心机自然停止转动后，取出离心管，关闭电源。 六、溶液的混匀 欲使化学反应充分进行，必须使反应体系内的各种物质迅速地相互接触。溶液混匀可随使用器皿、液体容量而选用下列不同的方法。
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