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医学/药学考试

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本科教材

医学遗传学实验指导-(供基础.临床.预防.口腔医学类专业用)(第2版)

作者：左囗

出版社：人民卫生出版社出版时间：2008-06-01

所属丛书：全国高等学校配套教材

开本： 16开 页数： 77

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版权信息
节选

医学遗传学实验指导-(供基础.临床.预防.口腔医学类专业用)(第2版) 版权信息

ISBN：9787117101783
条形码：9787117101783 ; 978-7-117-10178-3
装帧：暂无
册数：暂无
重量：暂无
所属分类：
医学
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本科教材

医学遗传学实验指导-(供基础.临床.预防.口腔医学类专业用)(第2版) 节选

bsp;        前言
    尽管全国有许多医学院校的各类医学专业已开设了“医学遗传学”课程，但相应
的“医学遗传学实验(或实习)课”却显得相对薄弱。一方面受现实条件的限制(包
括课时、学生数、实验室条件等等)，以至于不能满足开设医学遗传学实验(实习)
的实际需要；另一方面医学遗传学实验(实习)所涉及的范围广泛(宏观的内容可涉
及人群或个体、微观的内容则可达细胞、分子)，这使其在一个具体的教学实验室不
易得到实施。然而其本身的性质决定了实验(实习)教学在医学遗传学课程学习中具
有重要的意义，因此，在可能的情况下，我们提倡应积极争取实验课的开设。
    作为横跨基础医学与临床医学的桥梁课程，“医学遗传学”既带有基础医学实验
的性质，也具有临床医学实习的特点，但我国绝大多数医学院校的医学遗传学教学是
由从事基础医学教学和研究的老师担任的，故无法实现医学遗传学所具有临床性质的
教学。我们在编写这本《医学遗传学实验指导》时，试图兼顾基础和临床两个方面，
意在鼓励有条件的学校加强基础医学与临床医学老师的合作，使医学遗传学教学走进
病房、门诊，走进社区。
    《医学遗传学实验指导》包括：遗传病的家系分析、群体遗传分析相关的实验、
染色体分析相关的实验、基因检测相关的实验、医学遗传学综合实验和附录等六章，
分别代表医学遗传学实验的群体、家系、细胞、分子等四个层次和一个综合性实验，
每一个层次又包括若干个具体的实验，在使用本教材时，可根据实际情况，选择其中
的一些实验作为代表进行教学。书后的附录包括了一些医学遗传学技术上的进展，供
有兴趣的使用者学习时参考。
    对于某一个具体的实验而言，每一个实验室可能有其自己的方法，本教材中所提
供的只是一些基本的方法，在具体教学中，师生可根据自己的实际情况加以修改。
    本教材作为全国高等医药规划教材《医学遗传学》(第5版)的配套教材，在编
写过程中，得到了复旦大学上海医学院的大力支持，谨表衷心感谢。对教材中所存在
的不当之处，希望大家及时指出，以便改进。
    左伋
    2008年3月

基因检测相关的实验
    人类基因组计划的完成以及后基因组学研究的不断深入，标志着现代医学的发展
已逐步进入“基因组医学”的时代。疾病分子机制的研究也将为包括疾病的分子诊
断、分子治疗在内的“分子医学”的发展提供动力。其中分子诊断技术已在许多临床
领域得到运用，这必将为二十一世纪人类医疗保健带来福音。因此，从分子水平上了
解医学遗传学相关的实验技术对于现代医学教育与医学实践具有十分重要的意义。
    实验4=1 人基因组DNA的提取
一、实验目的
1．了解提取DNA的原理。
2．掌握人外周血基因组DNA的提取方法。
二、实验原理
从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的DNA是进行基因诊断的先决条件。制
备高质量DNA的原则是：①将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净；②尽可能保持
DNA分子的完整性。
    在提取DNA的反应体系中，蛋白酶K为广谱蛋白酶，其主要特征是在十二烷基
磺酸钠(SDS)和乙二胺四乙酸(EDTA)存在的情况下保持很高的活性，可将蛋白
质降解成小的多肽和氨基酸。哺乳动物DNA的提取一般是在有EDTA及SDS一类
的去污剂存在下进行的，SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：①破坏细胞膜及
核膜；②解聚细胞中的核蛋白；③与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来；④抑制
DNA酶活性，使DNA分子尽量完整地分离出来。经典的提取的方法为酚一氯仿法，
该法提到的DNA纯度较高，可用于Southern分析和构建基因组DNA文库。
三、实验用品和材料
(一)试剂
1．抗凝剂EDTA 2％(W／V)生理盐水抗凝剂。称取2g乙二胺四乙酸二钠
0．85g NaCl，加双蒸水至100ml。本试剂lml可抗10ml全血凝结。亦可用医用ACD
抗凝剂抗凝。肝素能抑制限制性内切酶活性，因此一般不用肝素抗凝。
    2．TES溶液15 mmol／LTris-HCl(pH8．0)，15mmol／LEDTA(pH8．0)，
15mmol／L NaCl。用1mol／LTris-HCl(pH8．0)，0．5mmol／LEDTA(pH8．0)，
3mol／L NaCl稀释成15mmol／LSTE溶液。
    3．10％(W／V)SDS。
    4．15mmol／LTES饱和酚重蒸酚在热水浴(100℃)中溶化后加人l／3体积的
15mmol／LTES溶液，充分混匀后，放冰箱中静置6小时以上。酚层在下，水层在
上。吸掉上层多余的TES溶液，冰箱中避光保存备用。为防止酚被氧化成酮．可加
少量8一羟基喹啉(2～5mmol／L）
    5．氯仿／异戊醇(24：1，V／V)。现用现配。
    6．蛋白酶K(]0mg／ml)。
    7．TE溶液10mmol／LTris-HCl，1mmol／LEDTA(pH7．5)。用lmol／LTris-
HCl(pH7．5)，0．5mol／LEDTA(pH 7．5～8．0)稀释配制。
    (二)器材
    Eppendorf管、离心管、吸管、加样器、枪头、离心机、水浴箱、紫外分光光度
计、电泳仪、电泳槽。
    四、实验方法和步骤
    (一)酚一氯仿法
    1．白细胞的分离
    (1)抗凝血用l～2倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水(PBS)稀释，混合好。
    (2)在50ml离心管中加入1倍体积淋巴细胞分离液，在上面仔细铺一层两倍体
积已稀释的血液。
    (3)在室温以2000rpm离心15～20分钟，红细胞应沉于管底，而白色的淋巴细
胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。
    (4)吸弃血浆，小心吸取淋巴细胞层。直至把淋巴细胞转移完全。
    (5)用生理盐水或PBS洗淋巴细胞两次。
    (6)*后得到的淋巴细胞沉淀，可立即用于DNA的提取，或冻存于超低温冰箱
中，直至使用。
    2．DNA的提取
    (1)在5ml 15mol／LTES中悬浮白细胞，加蛋白酶K 250～3501ug(50～70μg／
ml)，10％SDS至终浓度0．5％(加260μ1左右)。
    (2)充分混匀，放50。C水浴中保温3～5小时。其间振摇2～3次。
    (3)冷却至4℃，加等体积15mol／LTES饱和酚。
    (4)轻轻摇，使水相和酚层充分混匀。
    (5)4℃ 5000～8000rpm离心15～20分钟。此时DNA溶液在上层，酚位于下
层，中间是变性蛋白层。
    (6)用吸管小心吸取上层黏稠溶液，移至另一离心管。注意尽量不要带出中间蛋
白层。
    (7)DNA溶液再加等体积15mol／LTES饱和酚抽提一次，按(5)、(6)离心并
吸至另一离心管。
    (8)加等体积氯仿／异戊醇，按步骤(4)、(5)抽提。离心5分钟。
    (9)吸出DNA溶液后，再步骤(8)抽提一次。
    (10)用吸管将DNA溶液移至Eppendorf管中，冰浴至0℃。
    (11)加2．5倍体积95％冷乙醇。振摇，可见DNA白色沉淀析出。
    (12)用75％冷乙醇清洗3～4次。
    (13)室温干燥或冷冻干燥DNA。
    (14)加适量TE溶液溶解DNA。
    (二)盐析法
    1．取2～3ml新鲜或冻存的EDTA抗凝血，置于10ml的离心管中。
    2．加2～3倍体积的红细胞裂解液(blood buffer)：0．01mol／L Tris-HCl
pH7．6、0．01mol／LNaCl、0．005mol／LMgCl2，剧烈振荡15秒，冰浴15分钟。
2000rpm离心10分钟。
    3．移弃上清液，约留0．5ml，再用同体积的红细胞裂解液裂解红细胞，2000rpm
离心1()分钟。
    4．重复步骤2，直到液体发白。
    5．收集沉淀用生理盐水洗涤2次，收集白细胞沉淀，并转至1．5ml的Eppendorf
离心管中。
    6．沉淀中加入300rd TE溶液混匀，再加15}tl 10％的SDS及蛋白酶K至终浓度
0．5mg／mI，37。C过夜消化。
    7．加入l／3体积的过饱和NaCl，轻轻摇匀1分钟，5000rpm，离心10分钟，取
上清液移人一新的Eppendorf管中。
    8．加入2～3倍体积的无水乙醇，沿管壁慢滴入，可见絮状物析出(即DNA)。
    9．挑出DNA，用75％酒精漂洗絮状物，12000rpm离心3分钟。
    10．弃去酒精。室温自然干燥后，加100btl无菌双蒸水溶解DNA。
    11．测定DNA的浓度或4℃冰箱保存。
    (三)DNA的鉴定及定量
    1．比色法取DNA溶液20μl，用蒸馏水稀释至400μl。以蒸馏水做空白，在紫
外分光光度计上测定OD260、0D280、OD230三个数值。对于纯DNA，1OD260＝50μg／
ml DNA，因此DNA含量应为：50μg／ml×OI)26。×稀释倍数。
    按上述稀释20倍样品读数，50μg／ml×20倍等于lmg／ml，因此所读出的0D260
数值即为样品稀释前的浓度(mg／ml）。例如OD260数值为0．54，则DNA浓度为
0．54mg／ml。根据含量计算总DNA的量。